在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，需將試劑盒從冰箱中拿出來(lái)在室溫放置20min，再進(jìn)行測(cè)定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡，也可使溫育時(shí)反應(yīng)孔內(nèi)的溫度能較快的達(dá)到所要求的高度，以滿足測(cè)定要求。 其次，目前商品中ELISA試劑盒中的洗板液均需在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)其所提供的濃縮液進(jìn)行稀釋配制，因此稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)該保證質(zhì)量。此外，底物反應(yīng)液應(yīng)該反應(yīng)顯色前進(jìn)行現(xiàn)配現(xiàn)用。同時(shí)，為了保證實(shí)驗(yàn)的均一性，實(shí)驗(yàn)中所有試劑在加樣前必須搖勻。

用于ELISA測(cè)定最常用的臨床標(biāo)本是血清（漿）。要注意避免嚴(yán)重溶血，因?yàn)檠t蛋白中含有具有類(lèi)似過(guò)氧化物活性的血紅素基團(tuán)，在孵育時(shí)很容易吸附于固相，與HRP底物反應(yīng)產(chǎn)生假陽(yáng)性。 樣品采集及血清分離中要注意避免細(xì)菌污染，一方面細(xì)菌分泌的酶可能對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用，另一方面，細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶會(huì)對(duì)相應(yīng)酶作標(biāo)記的測(cè)定方法產(chǎn)生非特異性干擾。 樣品應(yīng)該要避免反復(fù)凍融。因反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。另外，樣品混勻時(shí)，不要?jiǎng)×艺袷帲磸?fù)顛倒混勻即可。 一般而言，如果在收集樣品的當(dāng)天進(jìn)行檢測(cè)，可將樣品及時(shí)儲(chǔ)存在4℃?zhèn)溆?；而?duì)隔天再檢測(cè)的樣本，應(yīng)及時(shí)分裝后凍存在-20℃?zhèn)溆?，若要長(zhǎng)期保存樣品，最好將其置于-70℃凍存。

誤差分為三類(lèi)，系統(tǒng)誤差、隨機(jī)誤差和過(guò)失誤差。這三類(lèi)誤差中，系統(tǒng)誤差對(duì)樣本值和空白值之間的差異無(wú)影響。ELISA樣本值低于空白值在誤差方面主要來(lái)源于隨機(jī)誤差和過(guò)失誤差。 隨機(jī)誤差?Random?Error 無(wú)法控制的變因，使測(cè)量值產(chǎn)生隨機(jī)分布的誤差，服從統(tǒng)計(jì)學(xué)上的正態(tài)分布。從統(tǒng)計(jì)學(xué)上來(lái)看，測(cè)量值有99%的置信限在±3SD之間，如果CV值是20%，隨機(jī)誤差的邊界就是±60%，也就是說(shuō)在CV值20%的狀況下，樣本值低于空白值60%之內(nèi)，有可能是隨機(jī)誤差的影響，特別是空白值只有一個(gè)值時(shí)。 隨機(jī)誤差不可消除，只能通過(guò)多次測(cè)量獲得的均值盡量逼近真值。降低隨機(jī)誤差的解決方案1是增加空白值的重復(fù)數(shù)量，一般認(rèn)為空白值重復(fù)10次，測(cè)量均值接近真值。 方案2是提高實(shí)驗(yàn)技能，也能夠有效降低隨機(jī)誤差的影響。如果CV值在5%，樣本值趨近于零時(shí)，在統(tǒng)計(jì)上樣本值將不會(huì)低于空白值15%。 過(guò)失誤差?Gross?Error 過(guò)失誤差主要是由于測(cè)量者的疏忽，犯了不應(yīng)有的錯(cuò)誤造成的。過(guò)失誤差是可以避免的。針對(duì)于ELISA樣本值低于空白值的問(wèn)題，過(guò)失誤差產(chǎn)生的原因多數(shù)來(lái)源于空白孔HRP的重復(fù)加樣或污染或洗滌不干凈，造成空白值偏高，相對(duì)比來(lái)說(shuō)，樣本值低于空白值。解決方案就是重復(fù)實(shí)驗(yàn)，規(guī)范操作。 基質(zhì)效應(yīng)?Matrix?Effect 分析中，基質(zhì)指的是樣本中被分析物之外的組分，基質(zhì)常常對(duì)分析物的分析過(guò)程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，這些影響和干擾被稱為基質(zhì)效應(yīng)。ELISA試劑盒在開(kāi)發(fā)過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)品不能采用人或動(dòng)物血清、血漿作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的稀釋液，只能采用其模擬物。模擬物與被測(cè)樣本在蛋白豐度、復(fù)雜性、pH等因素都會(huì)存在差異。當(dāng)樣本的基質(zhì)與其模擬物相比，降低抗原抗體的結(jié)合，便產(chǎn)生了樣本值低于空白值的現(xiàn)象。造成樣本值無(wú)法計(jì)算出數(shù)值，或者數(shù)值為負(fù)。 目前最常用的去除基質(zhì)效應(yīng)的方法是，通過(guò)已知分析物濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，同時(shí)盡可能保持樣本中的基質(zhì)不變，建立一個(gè)校正曲線（Calibration?Curve）。 當(dāng)單個(gè)樣本或少量樣本值低于空白值時(shí)，可能是誤差原因，這時(shí)應(yīng)增加重復(fù)，提高操作技能。當(dāng)大量樣本都低于空白值時(shí)，應(yīng)考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響，建立校正曲線予以修正。

在ELISA實(shí)驗(yàn)中，樣本值低于空白值是一個(gè)經(jīng)常性的問(wèn)題。當(dāng)樣本值較低接近試劑盒的靈敏度就容易發(fā)生樣本值低于空白值的現(xiàn)象，特別是在血清和血漿樣本的檢測(cè)。究其原因，主要在于兩個(gè)方面，一方面是誤差，另一方面是基質(zhì)效應(yīng)。下文逐個(gè)分析不同影響因素的原理、和解決方案。

血清、血漿樣品請(qǐng)務(wù)必按照說(shuō)明書(shū)要求，與稀釋液1：1稀釋后再加樣。這類(lèi)樣品蛋白質(zhì)含量高且成分復(fù)雜，容易造成對(duì)監(jiān)測(cè)孔上的抗原表位的遮蓋，與稀釋液1：1稀釋后可有效避免這一問(wèn)題。

溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素。為了使所有樣本在一致的溫度下反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)前務(wù)必將所有試劑平衡至室溫，包括檢測(cè)樣本。避免因溫度的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)差異而導(dǎo)致ELISA檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。

首先，酶標(biāo)儀使用前務(wù)必預(yù)熱10-15min，使測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。其次，ELISA實(shí)驗(yàn)采用雙波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，可以排除單波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)的測(cè)定干擾（標(biāo)本的濃度，干擾色等）。一般采用最大波長(zhǎng)作為參照波長(zhǎng)，在參照波長(zhǎng)下，檢測(cè)物的吸光值最小，檢測(cè)波長(zhǎng)和參照波長(zhǎng)的吸光值之差可以消除非特異性吸收；因此，雙波長(zhǎng)測(cè)定，可最大限度的消除指紋、雜質(zhì)及不透光的物質(zhì)對(duì)酶標(biāo)儀讀數(shù)帶來(lái)的誤差，以保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。

振蕩孵育使反應(yīng)更充分，振蕩洗滌使背景更干凈。建議使用酶標(biāo)專(zhuān)用96孔微孔板振蕩器。孵育過(guò)程振蕩，可以加快、加強(qiáng)抗原抗體分子間的相互碰撞接觸，使得反應(yīng)過(guò)程更加完全，OD值通常會(huì)比未振蕩孵育的結(jié)果要高；洗滌過(guò)程振蕩，可以使洗板更干凈，在很大程度上能降低背景值，同時(shí)可以提高試劑盒檢測(cè)的靈敏度。